1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。
2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染Marker 即可。陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。
3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低,應延長孵育時間為10小時或過夜。
6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。
7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。