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抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的操作步驟

發(fā)布時間: 2023-10-20  點擊次數(shù): 647次

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的操作步驟

抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)是破骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶,特異性分布于破骨細(xì)胞中。TRAP染色試劑盒即是用于顯示組織中的破骨細(xì)胞。其中基本原理在于,在含酒石酸的酸性條件下,抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP能將萘酚AS-BI磷酸鹽水解,產(chǎn)生的萘酚AS-BI與六偶氮副品紅結(jié)合,形成非水溶性的酒紅色物質(zhì)沉積在酶活性原位,從而實現(xiàn)對抗酒石酸酸性磷酸酶的顯色和定位。本產(chǎn)品基本組成成分:反應(yīng)緩沖液主要成分為醋酸緩沖液及酒石酸鉀鈉,pH約5.0;副品紅溶液,含5%副品紅;亞硝酸鈉溶液主要成分為4%亞硝酸鈉;AS-BI磷酸鹽底物溶液,主要成分為20 mg/mL萘酚AS-BI磷酸鹽。經(jīng)本產(chǎn)品染色后,破骨細(xì)胞中的TRAP呈酒紅色,定位于細(xì)胞漿。按照切片上每個組織點300 μL用量,本試劑盒可以做50次以上TRAP染色。

儲存與運輸:冰袋(wet ice)運輸;2-8℃避光保存,其中AS-BI磷酸鹽底物溶液-20℃保存,有效期12個月。

配制TRAP工作液:

(1)取50 μL副品紅溶液(G1050-2)與50 μL亞硝酸鈉溶液(G1050-3)在潔凈離心管中混勻,得到六偶氮副品紅溶液;

(2)向第1步的100 μL六偶氮副品紅溶液中加入100 μL AS-BI磷酸鹽底物溶液(G1050-4),吹吸數(shù)次充分;

(3)吸取1.8 mL反應(yīng)緩沖液(G1050-1)加入到第2步的混合液中充分混勻;

(4)第3步的混合液經(jīng)針式濾器過濾(0.45 μm水系濾膜)即得到TRAP工作液。

注意:務(wù)必按照所屬順序配制工作液。每個組織點大約需要200-300 μL工作液,根據(jù)使用量配制,現(xiàn)配現(xiàn)用,避免浪費。

石蠟切片操作步驟(供參考)

1. 石蠟切片脫蠟至水,純水洗數(shù)分鐘。

2. 將切片用組化筆化圈后放在(加有一定量的防止切片蒸干的純水)濕盒中,用純水37℃孵育2 h。

3. 切片孵育完成后傾去純水,滴加過濾好的TRAP工作液覆蓋組織,置于37℃避光反應(yīng)20-30 min。

4. 復(fù)染細(xì)胞核:傾去孵育液并水洗,以蘇木素染液進行染核。

5. 脫水,透明,以中性樹膠封片。

細(xì)胞爬片操作步驟(供參考)

1. 細(xì)胞固定:吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入4%多聚醛固定15-30 min,蒸餾水洗3次。

2. 細(xì)胞破膜:以0.2% Triton X-100溶液覆蓋細(xì)胞進行破膜處理20-30 min,蒸餾水輕洗3遍。

3. 孵育染色:將TRAP工作液加到細(xì)胞孔板內(nèi)覆蓋細(xì)胞,37℃避光孵育20 min,蒸餾水洗3次。

4. 細(xì)胞核復(fù)染:吸除孵育液并水洗,以蘇木素染液進行染核。

5. 加入適量無水乙醇脫水,取出孔板中的蓋玻片,吹風(fēng)機吹干,倒扣在潔凈的載玻片上以中性樹膠封片。

實驗流程:脫蠟至水—染液配制-Trap染色-蘇木素淺染核-脫水封片-顯微鏡鏡檢   

結(jié)果判讀:破骨細(xì)胞呈酒紅色或淺紅色,細(xì)胞核呈淺藍(lán)色

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的操作步驟

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