明膠酶譜檢測試劑盒
簡介:
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視。
本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9 活性Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達 1nM,高于 ELISA 方法 2,其基本原理和程序是: 制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,電泳結束后取出凝膠與酶反應 Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解舒膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透 亮區(qū)域,從而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩中液,可檢測少至0.10-0.5ul血液中的MMP-2、MMP-9 譜及活性,檢測靈敏度~1 nM。試劑盒可進行 50 次標準小較檢測,如果小較加樣為 10-15個,則總計可檢測500-750 個樣品。
檢測目的:
本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM)
檢測步驟:
5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 oC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。、
5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染Marker 即可。陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。
注:因為全血成分復雜,MMP活性較低,的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照
5.3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
5.4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5.5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37oC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低,應延長孵育時間為10小時或過夜。
5.6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。
5.7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
檢測原理:
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達1 nM,高于ELISA方法,其基本原理1和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,電泳結束后取出凝膠與酶反應Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區(qū)域,從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液,可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性,檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測,如果小膠加樣孔為10~15個,則總計可檢測500~750個樣品。
說明:
1. 10 mM 能夠EDTA*抑制MMP活性。
2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留。
參考文獻:
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102,196–202
SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書
常規(guī)考馬斯亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高,但所需試劑復雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。
安全性:含有甲醇,無特殊毒性,按一般化學品操作規(guī)程處理。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝膠,并緩慢搖動2h;
2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;
3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進行脫色,直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景(通常此過程需要2~4h,也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景);
4. 對凝膠進行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對凝膠進行處理后保存。
說明:
1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至1000ml,混合1h 后用Whatman 1 號濾紙過濾,于室溫可無限期保存;
2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V);
3. 保存液:7%冰醋酸;
4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),室溫或4 oC 保存,可反復使用2-4 次。
本產(chǎn)品僅供科研,不得用于臨床,醫(yī)療,食用等
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