血液總RNA提取試劑程序

描述：血液總RNA提取試劑特別加強(qiáng)了對(duì)液體標(biāo)本如全血等RNA的提取能力。直接將液體標(biāo)本與血液總RNA提取試劑混合即可，極大簡化了樣品的提取前處理過程。并且其提取能力強(qiáng)大，甚至可以從已經(jīng)凝固的血液塊中提取出高純度的RNA。使用方法與RNAtrip 和TRIzol相似，可在30－60分鐘內(nèi)完成。獲得的高純度總RNA可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保護(hù)、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。 

儲(chǔ)存：4oC密封避光保存一年以上有效。
適用：液體標(biāo)本(200µl/ml): 全血、體液、尿液，懸浮細(xì)胞、病毒微生物樣品等。

RNA提取程序
液體標(biāo)本：全血、體液、尿液，懸浮細(xì)胞、病毒微生物樣品等。每200ml液體樣品加1 ml RNAtrip LS，置冰上。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。
1. 將裂解物轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，置冰上10分鐘。如需暫停操作，裂解物可凍存于－70 oC至少一個(gè)月。
2. 加入0.2體積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰上孵育1－5 分鐘，溶液開始分相。有時(shí)分相不明顯，不影響提取。
離心12,000g 4 oC 10 分鐘，溶液分為兩相。RNA保留于上層無色透明水相約0.6ml，下層為有機(jī)相，兩相界面是一層薄膜其厚度與組織細(xì)胞類型和多少有關(guān)。小心吸出上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管，但應(yīng)留0.5－1 mm厚水相，以免擾動(dòng)和吸入下面的碎片和無機(jī)相。如吸入無機(jī)相和碎片，應(yīng)將所取水相放回管中并重新離心10分鐘，再吸取水相。這一點(diǎn)至關(guān)重要，違背此原則容易導(dǎo)致RNA降解和DNA污染。
3. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于含有上清的新離心管中，充分混勻。冰上孵育10 分鐘綽綽有余。但－20 oC 放置一至數(shù)小時(shí)，可回收幾乎所有的RNA。如需盡可能多的RNA，或起始組織細(xì)胞的量很少，或用戶需要暫停操作時(shí)，可以這樣做。用更低的溫度和更長的時(shí)間進(jìn)行沉淀并不必要。
4. 離心, 12,000g，4 oC，10分鐘。小心棄上清，管底可見少許黃白色RNA沉淀。如初始組織細(xì)胞量少，RNA沉淀用肉眼幾乎難辨，但不影響實(shí)驗(yàn)。
5. 洗滌沉淀。立即加入1 ml 75%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，12,000g 5分鐘。棄上清，盡量吸去管壁上的液體。乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉RNA沉淀。此時(shí)可將RNA沉淀保存在75%乙醇中，4 oC一周或－20 oC一年。
6. 敞開管口空氣干燥5-10分鐘，RNA沉淀干燥至膠凍狀即可。過分干燥將使RNA難以溶解。用50-100 ml DEPC處理的高壓消毒純水或TE溶解沉淀。如RNA難溶，可55 oC加熱10分鐘，或反復(fù)凍融數(shù)次助溶。RNA溶液可保存于－70 oC或液氮中；或加3倍體積乙醇－20 oC凍存，用時(shí)離心沉淀。
7. 測定OD值。計(jì)算RNA濃度和OD260/280比值。RNAtrip LS提取的RNA絕少蛋白污染，比值通常在1.6－2.0之間均屬正常。OD260/280比值受很多因素影響。起始組織量過大或RNAtrip LS試劑過少，或吸取了有機(jī)相或碎片，將使OD260/280比值降低，應(yīng)預(yù)以避免；RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，而用TE或離子強(qiáng)度較高的溶液溶解時(shí)該比值較高，但均不影響RNA使用。用戶應(yīng)該知道，即便是已降解的RNA，該比值也能達(dá)到看似完-美的2.0左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否的指標(biāo)?？蛇M(jìn)行RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性(見說明2)。